De alkoholene som oftest benyttes som antiseptika i helsevesenet er etanol og isopropanol. Den viktigste virkningsmekanismen synes å være denaturering/koagulering av proteiner. Koagulering av proteiner er konsentrasjonsavhengig. Den påvirkes av vann, og dersom det ikke er vann til stede, reduseres denatureringen. Dette er forklaringen på at absolutt etanol har mindre baktericid effekt enn blandinger av vann og etanol. Men det er også medvirkende til at alkoholer har redusert effekt i nærvær av organisk materiale. Vanlig brukskonsentrasjon for isopropanol er 60–70 %, mens den for etanol er 70–85 %. Alkoholene er miljøvennlige og etterlater ingen rester på huden, med unntak av glyserol som ofte er tilsatt alkoholer til hånddesinfeksjon som fuktighetsbevarende middel, men som ikke har antiseptisk effekt i seg selv.
Gram-negative bakterier er noe mer følsomme enn gram-positive. Isopropanol har litt bedre effekt enn etanol på bakterier. Alkoholene har liten effekt på bakteriesporer, f.eks. Clostridioides difficile. Sporer av Bacillus subtilis kan overleve i 95 % etanol i mange år. Desinfeksjonssprit kan faktisk inneholde bakteriesporer hvis den ikke er sterilfiltrert. Alkoholene er også aktive mot M. tuberculosis og mange sopparter. Ved tilsetting av klorheksidin øker effekten mot gram-positive bakterier.
Etanol og isopropanol virker også på mange virus, spesielt på virus med membran (lipofile virus), f.eks. influensavirus og herpes simplex virus. Det er også noen virus uten membran som betegnes som delvis lipofile/ intermediære fordi de binder seg til lipider, f.eks. adenovirus. Disse påvirkes også, men krever noe høyere konsentrasjoner, og det er variasjoner mellom ulike typer av adenovirus. Hydrofile virus påvirkes ikke av isopropanol, mens etanol har effekt på noen av disse, som rhinovirus og enterovirusene ekkovirus og coxsackievirus (men ikke poliovirus). Andre nakne virus, som f.eks. norovirus, humant papillomavirus, hepatitt A virus, parvovirus B19 er lite følsomme for alkoholene. Derfor anbefales håndvask fremfor hånddesinfeksjon med alkohol for å forebygge smitte med disse mikrobene.
Desinfeksjon av hud. Alkoholer gir betydelig reduksjon av bakterietallet på huden i løpet av sekunder. Den permanente bakteriefloraen reduseres med omkring 95 % og antallet temporære mikrober med 99–99,99 %. Effekten på bakterier som sitter dypt i huden i talgkjertler og hårfollikler påvirkes imidlertid i mindre grad. Ett eksempel er Cutibacterium acnes.
I praksis er virketiden kortvarig, fra noen sekunder til et par minutter pga. fordampning. Med virketid menes den tiden huden er fuktig. Effekten er ikke avhengig av at alkoholene skal tørke, men likevel anbefales det å vente til huden er tørr for å oppnå tilstrekkelig effekt. Det anbefales ikke å tørke av spriten fra huden med tupfer e.l., blant annet fordi man da risikerer å rekontaminere hudområdet. Alkoholer har dårlig evne til å trenge inn i organisk materiale og egner seg derfor bare til desinfeksjon av ren hud.
Alkoholene kan også brukes i blanding med andre desinfeksjonsmidler, f.eks. klorheksidin og jod. Dette er spesielt en fordel når man ønsker langvarig effekt, fordi disse midlene blir liggende igjen på huden når alkoholene fordamper.
Alkoholene tolereres godt ved bruk på hud, men isopropanol vil til en viss grad absorberes gjennom huden og egner seg derfor bare til desinfeksjon av mindre hudområder. Ved desinfeksjon av større hudområder bør etanol foretrekkes.
Hos helsepersonell som utfører hånddesinfeksjon mange ganger i løpet av en arbeidsdag, eller huddesinfeksjon på pasienter, kan det påvises svært små mengder etanol eller nedbrytningsprodukter i blod eller utåndingsluft. Men konsentrasjonene ligger langt under nivåer som har fysiologisk eller juridisk betydning (f.eks. ved bilkjøring).
Man må være oppmerksom på brannfare, spesielt ved samtidig bruk av elektrisk utstyr.
Resistensutvikling mot etanol og isopropanol i de konsentrasjoner som benyttes klinisk til antiseptiske formål er ikke ansett som et problem.